从实验室到临床 | 揭开三特异抗体研发的创新之钥

　　ISB-2001是由Ichnos Glenmark公司开发的一款First-in-class的BCMA/CD38/CD3三特异性抗体，于2023年进入I期临床，主要用于治疗多发性骨髓瘤（MM）。该抗体的CD38、CD3和BCMA结合臂全部为Fab结构，采用1:1:1设计。Fc段引入了L234A、L235A和P329A突变，去除ADCC效应。ISB-2001体外杀伤活性优于BCMA/CD3双抗和CD38/CD3双抗单药以及双抗联合，也优于已上市的CD38单抗Daratumumab和BCMA/CD3双抗Teclistamab，以及两者联用。已经被美国FDA授予孤儿药称号。

图1. ISB-2001三特异抗体结构示意图

　　在近期的Nature Cancer杂志上（IF>20），该公司发表了题为ISB 2001 Trispecific T Cell Engager Shows Strong Tumor Cytotoxicity and Overcomes Immune Escape Mechanisms of Multiple Myeloma Cells的文章，详细阐述了ISB2001的临床前研究结果。该研究中赛多利斯生物分析三大工具—iQue® 高通量流式，Octet® 非标记分子互作以及Incucyte® 实时活细胞成像系统大放异彩！我们来看看这个三特异性抗体药物的临床前研究怎么用这些仪器的？

　　Octet®非标记分子互作

　　抗体表位鉴定

　　Daratumumab是已经上市的CD38单抗。Octet®结果显示（下图），抗CD38-B3 Fab（ISB 2001抗CD38结合臂）能够在daratumumab存在下与CD38胞外结构域结合，表明两种抗体具有不同的结合表位。

　　图2. Octet®检测结果：用SA传感器固化CD38，依然可以与Daratumumab的CD38 Fab和ISB2001的CD38 Fab结合。

　　Octet®在药物研发中的优势是：

　　1.Octet®的BLI技术是美国药典和中国药物评审中心认可的检测动力学技术之一

　　2.与同类仪器相比，通量高，使用成本低，检测更快速

　　3.是生物制药的“多面手”，贯穿中抗体研发和生产的各个环节中，包括研发前期抗体库构建后的大规模筛选、亲和力的精确测定，研发后期的免疫原性测定，细胞株的筛选，生产阶段的残留物监控和抗体活性检测

　　iQue ®高通量流式

　　抗体和细胞亲和力测定以及肿瘤杀伤，T细胞活化

　　ISB 2001旨在通过BCMA和CD38的双重靶向介导与低水平表达TAA（肿瘤相关抗原）的肿瘤细胞的强结合。该细胞研究选择了三种MM细胞系，KMS-12-BM （BCMA低CD38低）、NCI-H929（BCMA中CD38中）和MOLP-8（BCMA低CD38的高）来模拟 MM 细胞上BCMA和CD38表达的多样性和异质性。在三种MM细胞系上，与CD3×DU×CD38和CD3×BCMA×DU对照相比，ISB 2001显示更强的结合能力和更低的 Kd值。这些数据证明了ISB 2001对双重靶向BCMA/CD38癌细胞的亲和力优势。

　　图3. 赛多利斯iQue ®高通量流式检测ISB 2001与三种细胞系的亲和力。上面为剂量结合曲线，下面为计算的最高信号和Kd 值。

　　另外，还用iQue®高通量流式比较了ISB 2001与靶向单价或二价BCMA抗体（teclistamab，EM801和alnuctamab）的细胞毒效价。ISB 2001在所有细胞系上均表现出比teclistamab和EM801更高的细胞毒效价，在NCI-H929和MOLP-8细胞系上表现出比alnuctamab更高的细胞毒效价。

　　图4. 计算死亡靶细胞的百分比以计算肿瘤细胞系杀伤效果。通过赛多利斯iQue®高通量流式细胞仪进行数据采集，并使用配套的ForeCyt 软件进行分析。

　　为了评估肿瘤相关抗原（TAA）结合域的相对位置是否影响功能，研究比较不同组合的CD3、BCMA、CD38（包括ISB 2001（CD3×BCMA×CD38）与CD3×CD38×BCMA，以及插入一个不相关的Fab（DU）的对照分子）的肿瘤杀伤能力。结果显示，当抗CD38和BCMA结构域更接近抗CD3结构域时，肿瘤细胞毒性更高(下图a,b)。然而，两种三特异性分子都显示出相似且有效的肿瘤细胞细胞毒性（下图c），表明CD38和BCMA中的任何一种都可以放置在抗CD3结构域附近，以获得最大的细胞毒性。

　　图5. 计算死亡靶细胞的百分比以计算KMS-12-BM肿瘤细胞系杀伤效果。通过赛多利斯iQue®高通量流式仪进行数据采集，并使用配套的ForeCyt 软件进行分析.

　　由于CD38在外周血中广泛表达，抗CD3和抗CD38结构域之间的接近可能在没有肿瘤细胞的情况下导致更高的T细胞活化。为此对ISB2001进行了on-target off-tumor测定。结果表明，ISB 2001的结构对肿瘤细胞保持了高毒性，同时在没有肿瘤细胞的情况下最小化的诱导了T细胞活化和细胞因子分泌。

　　图6. 赛多利斯iQue®高通量流式测试T细胞活化，即CD25+/CD8+ T细胞的百分比。

　　iQue®高通量流式细胞仪的优势在于：

　　1.高通量速度快：最快5分钟即可完成一块96孔板检测，本文中一半的数据都是该款流式测试的，说明其在药物研发中的高效

　　2.连续吸样和分析：大大加快流式细胞仪的样品分析和处理速度

　　3.强大软件功能：自己自动生成IC50、热图以及透视图等，不需要第三方软件

　　4.节约样品：最少仅需几微升样品，节约靶标抗原和珍贵细胞；

　　Incucyte®实时活细胞分析仪

　　实时观察肿瘤细胞和效应细胞的接触

　　随后，文章利用活细胞成像系统研究了肿瘤细胞与T细胞的相互作用。与对照组相比，ISB 2001加入后，T细胞与靶细胞显示出更高的接触率。这进一步验证了抗体的药物作用。

　　图7. 使用Incucyte® 实时成像对 不同浓度的ISB 2001、CD3 × BCMAxDU 和 CD3xDUxCD38下，对T细胞和KMS-12-BM肿瘤细胞的相互作用进行实时定量分析。用红色荧光染料标记KMS-12-BM细胞，并与绿色荧光染料标记的T细胞共培养，计算红色和绿色荧光叠加的面积。以×20物镜每30分钟采集一次图像，持续24小时。

　　Incucyte®的优势在于：

　　1. 培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害

　　2. 多个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高

　　3. 高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数

　　4. 大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol，文章数大于20,000篇

　　天下武功，唯快不破。赛多利斯生物分析三剑客——Octet®，iQue®和Incucyte®相比同类检测工具都具备更高的通量及更多的功能，可以帮助药物研发和科研工作者快速拿到准确的数据，在“内卷”的环境中迅速占领一席之地！